李斯特菌的危害和快检方法-mile米乐m6

李斯特菌的危害和快检方法

      李斯特菌广泛存在于环境中，并且在很多食品中有检出，该菌在低温的条件下仍能存活和增殖，其中单核细胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的主要致病菌之一，也是食品安全控制的重要病原体，感染后会造成不同程度的人员死亡，受到各国的高度重视。

      1、原理及适用范围

      李斯特菌检测板是一种预先制备好的一次性培养基产品，含有标准的营养培养基，选择性试剂，冷水可溶性吸水凝胶和β-d-葡萄糖苷酶(β-d-glucosidase)的显色底物( x-glu )，李斯特菌检测板适用于检测或者计数食品及环境样品中的李斯特菌菌数。李斯特菌检测板检测的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌(listeria.monocytogenes)，英诺克李斯特菌(listeria.innocua)，威氏李斯特菌(listeria.welshi)，但不能区分各种菌。

      2、操作方法

      2.1 食品样品检测

      2.1.1  食品样品处理：取样品25 g(ml)放入装有225ml灭菌磷酸盐缓冲液（或生理盐水）的取样罐或均质袋内，制成1:10的样品匀液。根据样品污染程度及检验需要，可进一步制成10倍递增的样品稀释液，选择2～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）来进行接种。 

      2.2 环境样品检测

      2.2.1  环境样品采集：用无菌的涂抹棒或其他采样设备收集环境样品。湿润采样设备液体体积≤10ml。湿润剂可以为无菌水，灭菌生理盐水（磷酸盐缓冲液）或者缓冲蛋白胨水。

      2.2.2  环境样品处理：在收集的环境样品中添加10ml 灭菌生理盐水（或磷酸盐缓冲液），充分混匀。根据样品污染程度及检验需要，可进一步制成10倍递增的样品稀释液，选择2～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）来进行接种。 

       2.3 接种：将李斯特菌检测板上层膜不干胶标签部分揭开，用无菌吸管吸取1 ml样品匀液均匀滴加到纸片上，迅速贴好上层膜并水平晃动检测板，静置10s左右，待样品匀液完全被吸附在滤纸上。每个稀释度接种两个检测板作为重复。

      2.4 培养：将检测板叠在一起，倒置于36℃±1℃恒温培养箱内，培养18～24h

       3、结果判读

       在检测板上生长的蓝绿色点即为李斯特菌阳性点，若检测板上无菌生长或者长出点为其他颜色点即为李斯特菌阴性。

      4  计数原则及报告方式

      4.1  样品计数

      4.1.1 以生长有30～300cfu的检测板为计数适宜范围。

      4.1.2 若只有一个稀释度检测板上的菌落数在计数合适范围30～300cfu之间，则计算两个检测板菌落数的平均值，再乘以相应的稀释倍数，作为每克（毫升）中菌落总数结果。

      4.1.3 若有两个连续稀释度在适宜计数范围内时，按式（1）计算：

                     ∑c

               n= ————————       •••••••••••••••••••（1） 

                   （n1 0.1n2）d

         式中：

        n——样品中李斯特菌菌落数；

        ∑c——两个连续稀释度检测板（含适宜范围菌落数的检测板）李斯特菌落数之和；

        n1——适宜范围菌落数的第一个稀释度（低）检测板个数；

        n2——适宜范围菌落数的第二个稀释度（高）检测板个数；

        d——第一稀释度的稀释倍数

       示例：

      结果表述为2.5×103cfu/g(ml)。

      4.1.4 若所有稀释度检测板上均无菌落生长，则以小于1/d（d—最低稀释倍数）计算。

      4.1.5 低数值的估算：如果实验样品原液（水及液体饮料）或初始稀释悬液（其他样品）的两个检测板上的菌落数均小于30cfu，计算两个检测板上的菌落数的平均数。计算式（2）：

                    ∑c

                  ne = ——    •••••••••••••••••••（2）

                        nd

      式中：

      ne——每毫升或每克样品中菌数的估算值；

      ∑c——两个检测板上菌落数的和；

      n——检测板的数量；

      d——样品初始悬液或实际接种悬液的稀释倍数。

      4.1.6 大数值的估算：若所有稀释度的检测板上菌落数均大于300cfu，计数最接近300cfu的检测板上的菌落并计算出平均数，其他检测板可记录为多不可计。结果计算式（3）：

                     ∑c

                ne = —— •••••••••••••••••••（3）

                      nd

      式中：

      ne——每毫升或每克样品中菌数的估算值；

      ∑c——两个检测板上菌落数之和；

      n——检测板的数量；

      d——与样品悬液相一致的稀释倍数。

       5、结果报告

      固体样品以cfu/g为单位报告，液体样品以cfu/ml为单位报告。

       6、附加说明

       注意使用过的检测板上带有活菌，需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理。

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